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中国生物化学与分子生物学报|用 suc²信号肽捕获系统筛选小鼠胚胎 cDNA 文库基因

作者:南京瑞源生物技术有限公司 浏览: 发表时间:2021-07-15 09:06:27

分泌性蛋白和细胞膜表面受体在生物体个体发育和生理功能的发挥及各种病理过程的演进中起着重要作用。1993年,Tashiro 等以IL-2受体作为报告基因首先建立了信号肽捕获系统,目前用该系统已经获得了大量编码分泌性蛋白和细胞膜表面受体的基因。

2004年4月第四军医大学研究团队在中国生物化学与分子生物学报发表了一篇名为“Screening of cDNA Library from Mouse Fetus Using suc2 Signal Sequence Trap”的文章揭示了用 suc2信号肽捕获系统筛选小鼠胚胎 cDNA 文库基因。


以插入有11d 小鼠胚胎 cDNA 文库的λ噬菌体 DNA 为模板,PCR 扩增文库cDNA,扩增产物用 Sal Ⅰ/Bgl Ⅱ酶切后插入筛选载体 pGUC-SB(Fig.1)的相应位点‚转化 E.coli DH5α感受态细胞进行扩增,将扩增后的质粒转化suc2基因缺陷的酵母细胞‚于非筛选平板(glu/-trp-leu)上生长2~4d 后收取菌落,将约105个酵母菌落接种于选择性平板(raf /-trp-leu),生长7d后挑取阳性菌落。


本研究用该系统对11d 小鼠胚胎 cDNA 文库进行筛选,从约105个酵母菌落中共获得182个可在选择性培养基上生长的菌落。PCR 扩增显示,插入片段大小分布于0∙1~1∙5kb 之间。对其中14个阳性菌落的重组子进行序列测定,结果显示它们分别代表6种不同的基因序列,与报告基因都有正确的读框内融合。其中两种基因序列反复被筛到,分别命名为 spt1、spt2,它们可能通过各自独特的机制介导蛋白质的分泌过程。

spt1、spt2编码信号肽的预测结果

spt1[gi:27728766]是5个以8#为代表的相同菌落,插入序列全长697bp,经 BLAST 分析表明,在非冗余序列库(non-redundant database)和小鼠表达序列标签库(mouse ESTdatabase)中没有发现同源的已知基因和EST(expressedsequence tag),所以spt1可能是一个新基因片段.可能以非编码 RNA的形式参与蛋白质向细胞外分泌的过程。


pt2是4个以12#为代表的相似菌落,它们最明显的特点是都含有一段12~24个连续的碱基 A,能够编码多个连续的疏水性赖氨酸,虽然对其所编码的氨基酸进行信号肽预测(Fig∙4),其所有评分都低于阈值(score=0∙5),但是其氨基酸组成结构与典型的信号肽十分相似,具有典型信号肽的3个分区,而且在实验中作为强阳性菌落(菌落长出时间<3d)被反复筛选到,所以考虑是软件预测的假阴性,或者是通过非经典的蛋白分泌途径起作用。


支持这个想法的依据至少有三点:a)统计学分析提示这么多相同的克隆不应该都是偶然的假阳性;b)蛋白转导现象提示存在着经典的分泌途径以外的蛋白分泌方式。蛋白转导结构域 (proteintransduction domain,PTD)是一种能够介导蛋白质多肽穿过细胞膜的一段短肽,其机制还不清楚。在分析了 PTD 和筛选到的由 poly(A)编码的肽段的氨基酸序列后发现,二者的碱基组成有相似点:二者的碱性氨基酸含量都较高;都有一个碱性氨基酸核,由5个氨基酸连续排列组成(PTD:Arg-Lys-Lys-Arg-Arg,我们得到的序列:Arg-Lys-Lys-Lys-Lys),而这个碱性氨基酸核被认为是PTD 介导蛋白转导最重要的部分c)已有文献报道poly(Lys)具有蛋白转导功能。Spt1是本研究中筛选到的一个新的 EST,虽然其3′端112bp 能够编码一个典型的信号肽,但是由于与 suc2基因读框内融合的序列所使用的起始密码子(ATG)上游还有14个ATG,这提示它不可能作为真正的翻译起始密码子。密码子分析提示,它可能是一个非编码 RNA(non-coding RNA,ncRNA)的一部分,对10种组织的总RNA进行 Northern 印迹分析显示:该序列仅表达于小鼠卵巢组织,全长约4∙5~5∙0kb,推测该序列可能以 ncRNA 的形式参与蛋白质向细胞外的分泌。




中国生物化学与分子生物学报|用 suc²信号肽捕获系统筛选小鼠胚胎 cDNA 文库基因
分泌性蛋白和细胞膜表面受体在生物体个体发育和生理功能的发挥及各种病理过程的演进中起着重要作用。1993年,Tashiro 等以IL-2受体作为报告基因首先建立了信号肽捕获系统,目前用该系统已经获得了大量编码分泌性蛋白和细胞膜表面受体的基因。
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