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TPC|俄亥俄州立大学研究团队利用信号肽跟踪筛选技术对RXLR效应因子的植物表达筛选揭示了不同表型茄抗病蛋白Rpi-blb2激活

作者:南京瑞源生物技术有限公司 浏览: 发表时间:2021-07-27 14:35:22

预测爱尔兰马铃薯饥荒病原体Phytophthora infestans会分泌数百种效应蛋白。为了解决将生物功能分配给计算预测效应基因的挑战,我们将等位基因挖掘与植物表达的高通量相结合。

2009 年 9 月 30 日俄亥俄州立大学研究团队在THE PLANT CELL发表了一篇名为“In Planta Expression Screens of Phytophthora infestans RXLRE ffectors Reveal Diverse Phenotypes, Including Activation of the Solanumbulbocastanum Disease Resistance Protein Rpi-blb2 ”的文章对晚疫霉RXLR效应因子的植物表达筛选揭示了不同的表型,包括茄抗病蛋白Rpi-blb2的激活。


本研究描述了基于植物细胞内表达的爱尔兰马铃薯饥荒病原体 RXLR 型效应器集合的活性筛选。这些蛋白质在卵菌中形成了一类关键的宿主易位效应子,其中一些是植物免疫系统的目标。


1.1等位基因挖掘和P. infestans RXLR 效应器的植物表达策略

为了识别具有新活性的 RXLR 效应器,我们设计了一种将等位基因挖掘与植物表达相结合的策略。

用于等位基因挖掘、克隆和 RXLR 效应子植物表达的效应组学概述

简而言之,设计了基于候选 RXLR 效应子(不含信号肽)的成熟区域的引物对,并用于从一组致病疫霉分离物中扩增基因组 DNA 。对所有扩增子进行测序以揭示检查的基因是否是多态的。如先前在致病疫霉中所述,经常观察到混合扩增子并且是杂合性或密切相关的旁系同源物的结果。序列中被认为是新的扩增子被优先克隆到根癌农杆菌二元马铃薯病毒 X 中(PVX) 载体 pGR106,可在植物中进行高通量筛选。克隆插入物被测序以产生非冗余克隆文库。微孔板与非冗余克隆的集合组装在一起,并用作植物内表达的模板,通过与特定R基因的共表达来测定细胞死亡引发和抑制以及无毒活性。


1.2大多数选定的 RXLR 效应基因在番茄感染过程中表达

为了确定P. infestans PexRD基因在植物定殖期间表达的程度,我们使用 RT-PCR 分析分析了P. infestans与其宿主植物番茄相互作用期间 32 个基因的表达。在用两种不同的致病疫霉分离物 90128 和 88069接种 (DAI) 后0、1、2、3、4 和5 天,从番茄叶片和体外生长的致病疫霉菌丝体中分离出总 RNA。组成型延伸因子 2 α ( ef2a ) 和植物内诱导的 Kazal 样蛋白酶抑制剂基因epi1 被用作对照。我们在至少一个检查阶段检测到 32 个基因中 30 个的转录本。其中,29 个基因在番茄定植期间表达,而PexRD4 的转录本仅在菌丝体中检测到。在感染时间点检测到PexRD3、 PexRD6 / ipiO、 PexRD8、 PexRD24、 PexRD31、 PexRD44、 PexRD45、 PexRD49和PexRD50九个基因的转录本,但未在菌丝体中检测到。这些结果表明,绝大多数选定的 RXLR 效应候选基因在番茄感染期间表达,与其预测的功能一致。


1.3RXLR效应器信号肽的功能验证

为了在功能上验证所选 RXLR 效应基因的信号肽预测,我们使用了基于酵母细胞对转化酶分泌要求在蔗糖或棉子糖培养基上生长的遗传测定。预测的信号肽序列和四个 PEXRD 基因PexRD6/ipiO、PexRD8、PexRD39和PexRD40的后续两个氨基酸与载体 pSUC2 中酵母转化酶的成熟序列框内融合。所有四种PexRD构建体都使转化酶突变酵母菌株 YTK12 在 YPRAA 培养基上生长(用棉子糖代替蔗糖,仅在转化酶分泌时生长) 

RXLR效应器信号肽的功能验证

使用酵母转化酶分泌试验对 PexRD6/IpiO、PexRD8、PexRD39和 PexRD40 的信号肽进行功能验证。携带与 pSUC2 载体中的转化酶基因框内融合的 PexRD 信号肽片段的酵母 YTK12 菌株能够在 CMD-W 培养基(含有蔗糖,酵母生长,即使在没有转化酶分泌的情况下)和 YPRAA 培养基(含有棉子糖而不是蔗糖,仅在转化酶分泌时生长),以及将 TTC 减少为红色甲臜,表明转化酶的分泌。对照包括未转化的 YTK12 菌株和携带 pSUC2 载体的 YTK12。


此外,转化酶分泌通过基于染料 2,3,5-三苯基氯化四唑 (TTC) 还原为不溶性红色三苯基甲的酶活性测试得到证实(图 2)。相比之下,阴性对照酵母菌株在 YPRAA 上不生长,TTC 处理的培养物滤液保持无色(图 2)。这些结果表明PexRD6 / ipiO、PexRD8、PexRD39和PexRD40的信号肽是有功能的,并证实了早期观察结果,即使用 SignalP 程序获得的预测是高度准确的。

 

文献链接:www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.109.068247

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