我们之前曾报道过包含 BTB（brica-brac、tramtrack 和 Broad）结构域的蛋白质 Clt1 可调节新月弯孢中的黑色素和毒素合成、分生孢子和致病性，但 Clt1 的相互作用蛋白质和调节机制尚不清楚。

上海交通大学研究团队在IS-MOMI 发表了一篇名为“The Role of Clt1-Regulated Xylan Metabolism in Melanin and Toxin Formation for the Pathogenicity of Curvularia lunata in Maize”的文章揭示了Clt1 调控木聚糖代谢在黑色素和毒素形成中对玉米弯孢菌致病性的作用。

1.筛选受 Clt1 调控的蛋白质

以前，我们表明含有 BTB结构域的蛋白质 Clt1 有助于毒素产生、黑色素和分生孢子的形成以及C. lunata 的致病性。为了了解 Clt1 介导的黑色素和毒素形成以及致病性的机制，我们使用酵母双杂交 (Y2H) 方法在C. lunata cDNA 文库中筛选了与 Clt1 相互作用的蛋白质。Clt1 相互作用蛋白之一是木聚糖酶，命名为 ClXyn24，另一个相互作用蛋白被鉴定为乙酰木聚糖酯酶并命名为 ClAxe43。我们预计 Clxyn24 和 Claxe43 在木聚糖代谢中具有相似的功能。

2.Clt1 与 Clxyn24 和 Claxe43 的相互作用

为了验证 Clt1 与 Clxyn24 和 Claxe43 的相互作用，我们进行了靶向 Y2H 和双分子荧光互补 (BiFC) 测定。Y2H 结果显示 Clt1 的全长与 Clxyn24 和 Claxe43 相互作用（图 1A和2A）。另外，附设检测表明，CLT1和Claxe43形式聚集体在烟草细胞，而交互CLT1和Clxyn24可以形成在细胞质和细胞膜附近的区域的聚集体（图. 1B）。我们推测 Clt1-Clxyn24 相互作用将木聚糖分解成靠近细胞膜的小分子寡糖，这些小分子寡糖可以通过 Clt1、Clxyn24 和 Claxe43 的组合进一步降解为木糖。将含有CLT1和绿色荧光蛋白cDNA 的融合片段转化到C. lunata CX-3 中以确定 Clt1 的亚细胞位置。结果显示 Clt1 蛋白定位于细胞质中，这与 Clt1 与烟草细胞细胞质中的 Clxyn24 和 Claxe43 相互作用的现象一致。

图1Clt1 和 Clxyn24 之间的相互作用

3.Clxyn24 和 Claxe43 参与木聚糖利用

为了研究 Clxyn24 和 Claxe43 的功能，将目标基因替换为潮霉素抗性盒。Δc lxyn24 & claxe43是双突变体，其中clxyn24和claxe43基因都被删除。菌株在固体培养基上生长，使用木聚糖粉作为唯一碳源来测试缺失突变体对木聚糖利用的影响（图4A）。Δ clt1、 Δc lxyn24、 Δ claxe43和 Δc lxyn24 & claxe43与野生型 (WT) 菌株相比，突变体没有表现出显着的木聚糖利用率。当我们用木糖作为碳源代替木聚糖时，Δ clt1的生长速度显着增加Δc lxyn24 & claxe4 3的生长速度略有增加。然而，Δc lxyn24和 Δ claxe43的生长速率与在木聚糖培养基上培养的相似。此外，突变体的木聚糖粉利用能力在液体培养基中也有所降低（图4A ）。与木糖利用相关的木糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶基因在突变体中显示出与WT相似的表达模式（图4B）。通过分析来自液体培养物的木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶的产生，进一步测试了突变体的木聚糖利用能力。在这些突变体中，木聚糖酶和碳水化合物酯酶的活性显着降低（图 4C）。这些结果说明 Clxyn24 和 Claxe43 与木聚糖利用有关。

图 4缺失突变体和野生型 (WT) 菌株的生长和木聚糖利用

这些发现表明，未知的调控途径可能将黑色素和毒素合成与C. lunata糖酵解产生的乙酰辅酶 A 联系起来，并且黑色素和毒素可能在感染过程中协同表达。重要的是，这项研究表明 Clt1 通过其 BTB 结构域与 Clxyn24 和 Claxe43 物理相互作用，该结构域在木聚糖代谢上游起作用。木聚糖的利用为黑色素和毒素、能量和其他中间代谢物的合成提供乙酰辅酶A，用于分生孢子（图12）

图 12木聚糖代谢提供乙酰辅酶A在黑色素和毒素的生物合成弯孢菌

文献链接：https://doi.org/10.1094/MPMI-08-20-0235-R