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MDPI|中国农业科学院研究团队用Y2H技术揭示棉花 BEL1 样转录因子 GhBLH7-D06 消极调节对大丽轮枝菌的防御反应

作者:南京瑞源生物技术有限公司 浏览: 发表时间:2021-09-06 10:03:26

黄萎病会严重影响棉花产量和纤维品质。BEL1 样转录因子参与次生细胞壁 (SCW) 形成的调节,尤其是木质素的生物合成,木质素在棉花抗病性中也起着关键作用。然而,关于BEL1-Like转录因子在植物生物胁迫调控中的作用尚未见报道。

中国农业科学院研究团队在MDPI发表了一篇名为“The Cotton BEL1-Like Transcription Factor GhBLH7-D06 Negatively Regulates the Defense Response against Verticillium dahliae”的文章揭示了棉花 BEL1 样转录因子 GhBLH7-D06 消极调节对大丽轮枝菌的防御反应。


在本研究中,组织表达模式分析表明,BEL1-Like 转录因子 GhBLH7-D06 主要在维管组织和纤维发育的 SCW 增厚阶段表达,同时其表达也可以响应大丽轮枝菌感染和植物激素 MeJA 处理,这表明 GhBLH7-D06 可能参与黄萎病的防御反应。使用病毒诱导的基因沉默 (VIGS) 技术,我们发现沉默GhBLH7-D06的表达可以增强棉花植物对黄萎病的抗性,抗性的获得可能主要是由于木质素生物合成和JA信号通路相关基因的显着过表达,这也证明GhBLH7-D06负调控棉花对黄萎病的抗性枯萎。


在之前的报告中,我们确定了 BEL1-Like 家族几个成员的转录自激活活性,这证明 GhBLH7-D06 没有自激活活性。因此,我们利用Y2H系统研究蛋白质之间的相互作用,阐明GhBLH7-D06转录因子在调节棉花SCW增厚和响应大丽花弧菌侵染中的调控机制。在Y2H文库筛选实验中,以棉花茎叶混合样品的酵母杂种文库为诱饵文库筛选GhBLH7-D06互作蛋白。共获得32个阳性克隆,包括1个KNOX家族蛋白knotted-1-like 3(GhKNAT3-A13)和1个OFP家族蛋白OFP3-like(GhOFP3-D13)。


根据诱饵蛋白GhBLH7-D06的筛选结果,我们进一步验证分析了KNOX家族和OFP家族成员作为候选靶蛋白。最后,通过分析表达模式,我们选择了 OFP 家族蛋白 GhOFP3-D13 作为候选捕获蛋白进行点对点验证。由于GhOFP3-D13在茎中表达占优势,在其他组织器官中表达量较低,可以认为是茎特异性表达基因。此外,在大丽花弧菌感染下,GhOFP3-D1 3的表达水平显着降低,GhOFP3-D13的表达水平显着降低。由SA显着诱导并且可以响应GA处理,但对IAA和MeJA处理没有明显响应(图5a -c)。克隆并构建了AD表达载体pGADT7-GhOFP3-D13。通过共转化,将pGADT7-GhOFP3-D13 + pGBKT7-GhBLH7-D06、阳性对照pGADT7-t + pGBKT7-53和阴性对照pGADT7-t + pGBKT7-lam转化到Y2H金酵母细胞中。通过PCR鉴定阳性转化体并在缺陷培养基上培养。结果表明,所有转化产物在SD- T/L缺乏培养基上生长良好,阳性对照组和实验组在SD- T/L/H/A+X-α-gal缺乏培养基上生长良好(图5d),表明 GhBLH7-D06 可以与 GhOFP3-D13 相互作用形成异源二聚体,共同调控棉花纤维 SCW 的合成和对大丽花弧菌感染的反应。

图 5. GhBLH7-D06 与 GhOFP3-D13 相互作用的验证以及 GhOFP3-D13 在棉花中的表达模式

基于酵母双杂交 (Y2H) 文库筛选和双分子荧光互补 (BiFC) 实验确认的结果,我们发现了一个卵形家族蛋白 (OFP) 转录因子 GhOFP3-D13,它也是棉花黄萎病抗性的负调节因子可能与 GhBLH7-D06 相互作用。此外,双荧光素酶报告基因检测和酵母单杂交(Y1H)实验表明 GhBLH7-D06 可以靶向结合GhPAL-A06的启动子区域抑制其表达并最终导致木质素生物合成的抑制。


总的来说,GhBLH7-D06/GhOFP3-D13复合物可以通过抑制木质素生物合成和JA信号通路负调控棉花对黄萎病的抗性。


文献链接:https://doi.org/10.3390/ijms21197126

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