研究技术背景简介

Y2H系统通常用于评估两个蛋白之间的直接相互作用，尽管事实上大多数天然蛋白质复合物是由两个以上的蛋白质组成的。即使是在两种蛋白质相互作用的情况下，通常也需要第三种蛋白质来稳定或促进两个伴侣之间的结合。为了研究这种高阶蛋白复合物，建立了酵母三杂交体系(Y3H)。

在Y3H系统中，第3个蛋白与DNA结合结构域(BD)-诱饵融合蛋白和转录激活结构域(AD)-猎物融合蛋白一起表达。第三种蛋白质通过直接结合或蛋白质修饰，如磷酸化，被纳入诱饵和猎物之间的蛋白质相互作用。如果诱饵和猎物(它们本身不会形成复合物)能与添加第三种蛋白质相互作用，报告基因就会被激活。

Y3H系统操作简单，可用于细胞内核酸水平实验验证，具有比酵母双杂交系统更广泛的应用范围，可通过第三个蛋白使两个杂合蛋白相互靠近，用于研究两个蛋白和第三个蛋白间的相互作用。第三个成分不同，可以是蛋白、RNA或小分子。同时还可以通过菌落生长状态来研究第三个蛋白对其他两蛋白的作用方式（如促进或抑制）。

小编以日本京都大学教授Koki Moriyoshi发表在影响因子IF=16.973 的Nucleic Acids Research上的一篇题为“pBT, a novel vector for tetracycline-regulated yeast three-hybrid assay”的研究文献为题材，为您讲解一下细胞体内三个蛋白之间如何触发CP感，该文报道了一个四环素调控酵母三杂交试验的新载体pBT（新生儿的诞生）

实验材料：酵母品系(AH109, Y187)，酵母载体(pBridge, pACT2)

研究结果

一、 酿酒酵母启动子活性比较

作者先进行了酿酒酵母启动子活性比较实验，图(A)为用于测定启动子活性的pBP载体图谱。几种哺乳动物，病毒或酵母组成启动子被用来驱动报告基因表达。图(B)为启动子活性的半定量比较。在启动子的下游插入一个flag标记的EGFP基因。在类似条件下捕捉表达EGFP的酵母细胞的图像。图(C)利用lacZ基因作为报告基因的启动子活性的定量比较。用ONPG法测定β-半乳糖苷酶活性。

图1：酿酒酵母启动子活性比较

二、 Dox剂量依赖的基因调控

为了描述tet介导的基因调控的细节，将重组蛋白的酵母细胞在不同浓度Dox下培养。通过EGFP荧光(图A)、FlagEGFP western blotting(图B)和lacZ活性(图C)显示，报告基因表达以Dox剂量依赖的方式被抑制。

图2 Dox剂量依赖的基因表达

三、Y3H验证

Dox反应组中没有已知的EGFR直接相互作用因子。对照研究证实，Sos1猎物仅在EGFRc诱饵和Grb2同时存在时引起报告基因激活，显示了Y3H的功能性相互作用(图3A)。在pBT中，通过EGFRcGrb2-Sos1 Y3H相互作用的报告基因激活以Dox剂量依赖的方式受到抑制，而在pBP中则相反 (图3B)。lacZ报告活性的定量测量也显示EGFRc-Grb2-Sos1 Y3H相互作用受tet介导的pBT系统调控(图3C)。

图3 使用pBT载体的Y2H和Y3H相互作用

(A) Y3H相互作用的确认。携带诱饵、猎物和第3基因(X表示没有相应基因)的细胞被标记到选择板上。只有形成蛋白复合物，细胞才能在SD/-Leu/Trp/-His/-Ade选择板上生长。所有的细胞都含有pBT和pACT2质粒，可以在SD/-Leu/-Trp板上有效生长。(B和C) Dox剂量依赖的EGFRc-Grb2-Sos1c形成。

研究结论

本研究描述了一种新型pBT Y3H载体系统的开发。Met25启动子系统可以通过控制培养基中的蛋氨酸来调控三杂交的形成。然而，在限制性条件下(存在1mM蛋氨酸)观察到显著的菌落形成，表明Met25启动子具有泄漏活性。还发现蛋氨酸消耗严重阻碍了常用AH109酵母株的生长。为了克服这些局限性，pBT系统利用tet介导的基因调控来驱动第3个蛋白，从而在不影响细胞代谢的情况下通过添加或去除Dox来控制Y3H相互作用。这一特性使得Y3H的筛选更加高效，因为Y3H相互作用可以通过简单的菌落复制到Dox(-)和Dox(+)平板上，很容易与背景Y2H相互作用区分开来。这种简单易用的pBT Y3H系统将有助于高阶蛋白复合物的高通量分析。

应用前景

pBT的一个优点是它在单个载体中包含GAL4BD-bait、tTA和3rd蛋白，这意味着它与现有的GAL4AD-prey文库完全兼容，如本研究使用的pACT2 cDNA文库。已经使用了GAL4 Y2H系统的研究人员可以通过简单地用pBT替换诱饵载体，轻松地将筛选升级为Y3H模式。

文献链接：doi:10.1093/nar/gkn969

投稿人：七七呗

审核人：哾十五

排版人：小皮杨