在开花植物的花粉粒外有一层坚硬的壁，被称为外壁(exine)。在大多数物种中，外壁不均匀地包裹着花粉粒，所以花粉的某些区域不被外壁所保护【1】。这些区域被称为花粉孔（pollen apertures），可以帮助花粉吸水并促进萌发。在拟南芥，水稻以及玉米中，INP1（INAPERTURATE POLLEN1）是调控萌发孔形成的主要调控因子，INP1的突变体会完全失去形成花粉孔的能力【2】。

由于INP1作为花粉孔调控因子的功能在拟南芥、水稻和玉米等远缘物种中是保守的，因此可以合理地假设被子植物的INP1都具有调控花粉孔形成的功能。但是INP1的蛋白在不同物种中存在巨大的序列差异【3】，且其他物种的INP1不能通过回补实验回补拟南芥INP1的突变体表型【4】。INP1功能的物种特异性说明可能存在一个与INP1协同进化的未知调控因子。

近日，俄亥俄州立大学Anna A. Dobritsa课题组在Nature Plants上发表题为A species-specific functional module controls formation of pollen apertures的学术论文，本文鉴定了INP1的互作蛋白INP2，发现INP1需要INP2发挥其功能，通过利用酵母双杂交技术，作者强有力的证明了INP1与INP2的互作是物种特异的，这些结果最终解释了花粉孔形成的物种特异性。 

一、正向遗传学鉴定到功能基因

为了鉴定花粉孔的调节因子，作者首先进行了正向遗传学筛选。在化学诱变的突变体库中，作者鉴定到了一个不形成花粉孔的突变体，命名为inp2-1（图一）。通过图位克隆技术，作者发现INP2编码了一个INP1的同源基因（图一），且其在花粉孔形成期间被诱导表达。

图一 INP2是花粉孔形成的调控因子

二、改进酵母双杂交方案确认INP1与INP2的互作

因为INP1与INP2表达模式相同，作者推测INP1与INP2存在互作。当利用全长进行酵母双杂交验证时，含有INP1与INP2的酵母菌并不能够在缺陷培养基上生长。进一步序列分析发现INP2含有一段跨膜结构域，这个结构域可能导致INP2定位于膜，从而无法激活酵母的报告系统。为了解决这个问题，作者将跨膜域去除，最终成功的通过酵母验证了INP1和INP2的互作（图二）。同时，作者通过双荧光互补技术（BIFC），双荧光素酶互补技术以及Co-IP等方法进一步验证INP1与INP2的互作（图二）。

图二 INP1与INP2互作

不同物种中的INP1不能互相替代，可能说明不同物种中的INP1与INP2的互作是特异的。为了说明这个问题，作者挑选了番茄中的INP1与INP2，通过酵母双杂交实验，发现番茄的INP1仅可以与番茄的INP2发生互作，而不能够与拟南芥的INP2发生互作，证明了INP1与INP2的互作是物种特异的。同时双荧光素酶互补技术也得到了相同的结果（图三）。 

图三 INP1与INP2的互作存在物种特异性

单独回补番茄INP1与INP2回补到拟南芥inp1无法回补inp1突变体的表型。由于INP1与INP2的互作是物种特异的，作者推测是由于番茄的INP1和拟南芥的INP2无法互作，从而无法发挥功能。所以，作者进一步将番茄的INP1和INP2同时在拟南芥inp1突变体中表达，发现表型恢复（图四）。

图四 同时回补番茄INP1与INP2可以回补拟南芥inp1突变体的表型

总结：本文是进化和表型研究的典范！通过巧妙的应用酵母双杂交技术，发现了INP1与INP2的互作在不同物种中的特异性，回答了不同物种花粉孔形成的特异性的问题。为今后提高花粉萌发率以及促进农业生产提供了理论基础。

参考文献

1. Furness, C. A. & Rudall, P. J. Pollen aperture evolution—a crucial factor for eudicot success? Trends Plant Sci. 9, 154–158 (2004).

2. Zhang, X. et al. Rice pollen aperture formation is regulated by the interplay between OsINP1 and OsDAF1. Nat. Plants 6, 394–403 (2020).

3. Dobritsa, A. A. & Coerper, D. The novel plant protein INAPERTURATE POLLEN1 marks distinct cellular domains and controls formation of apertures in the Arabidopsis pollen exine. Plant Cell 24, 4452–4464 (2012).

4. Li, P. et al. INP1 involvement in pollen aperture formation is evolutionarily conserved and may require species-specific partners. J. Exp. Bot. 69, 983–996 (2018).

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41477-021-00951-9