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酵母三杂交系统验证三个蛋白间互作--Y3H实现了赖氨酸甲基化阅读器的鉴定研究

作者:南京瑞源生物技术有限公司 浏览: 发表时间:2021-09-10 09:31:41

蛋白质翻译后修饰(PTMs)广泛存在于人类蛋白质组中,其生物学结果通常由特异结合修饰蛋白并触发下游效应的阅读蛋白间接介导。特别是组蛋白和非组蛋白之间的许多赖氨酸甲基化位点已经被描述;然而与它们相关的阅读器列表并不完整。


真核细胞利用蛋白质的翻译后修饰(PTMs)在结构和功能上使蛋白质组多样化。蛋白质甲基化是最广泛的PTMs之一,涉及大多数细胞过程和信号通路。蛋白质甲基转移酶修饰蛋白质中赖氨酸、精氨酸、组氨酸或谷氨酰胺残基的侧链,普遍存在赖氨酸和精氨酸甲基化。此外,蛋白质的N端和C端可以被甲基化。甲基化并不会从本质上改变赖氨酸侧链的生物物理特性,但它作为一种被称为“阅读器”的结合蛋白的对接位点,在染色质上发挥其功能。

德国斯图加特大学学者Albert Jeltsch课题组在BioMed central IF=14.911在线发表了题为Identification of protein lysine methylation readers with a yeast three‑hybrid approach的学术论文,本研究引入了一种改良的酵母三杂交系统(Y3H)来鉴定甲基赖氨酸阅读器,以赖氨酸甲基转移酶与其靶蛋白或蛋白结构域共表达作为诱饵,人类cDNA文库作为猎物。以H3K9me3为诱饵,以CBX1或MPP8的染色体结构域等已知的H3K9me3阅读器器为猎物,建立了实验设计模型。接下来,作者使用由人类特定的开放阅读框组成的文库进行了无偏差的筛选。它导致了对已知赖氨酸甲基化依赖的阅读器和新的赖氨酸阅读器候选的鉴定,并通过在人类细胞核中与H3K9me3的共定位进一步证实。


1、用于鉴定three proteins的Y3H实验设计模型的建立

图1  Y3H实验的工作流程示意图

2、Y3H方法鉴定甲基化阅读器的原理 

作者开发了一个修饰的Y3H系统,它在酵母细胞中表达三种蛋白质,即一个诱饵,一个修饰诱饵的PKMT,和一个负责识别甲基化诱饵的猎物。


如果甲基化的诱饵与猎物相互作用,GAL4转录因子就会重组并触发报告基因的转录(图2a)。为了验证被选择的猎物对甲基化依赖的诱饵识别的特异性,该系统也是在没有G9a-SET的情况下生成的。在这个控制设置中,猎物不应绑定未修改的诱饵。因此,GAL4不应该通过缺乏颜色变化和生长限制而重新构成(图2b)。

图2  Y3H方法鉴定甲基化阅读器的原理图

3、诱饵和猎物结构体在选择性培养基上的表达

首先,分别在Y2H Gold和Y187中验证结构体在不同选择培养基平板上的表达(图3a)。诱饵没有导致报告基因的自主激活,如SD-Trp/X-α-Gal平板上没有颜色变化。使用抗GAL4-BD或HA标签的抗体,通过western blot验证所有结构体的表达,以检测诱饵、G9a-SET结构域或猎物结构体的表达(图3b)。

图3 诱饵和猎物结构体的表达

4、Y3H系统对H3K9me3阅读器的鉴定

通过在营养缺陷选择培养基上的颜色变化和生长,观察到了报告基因的激活表达(图4)。没有发现生长或颜色变化,表明未修饰的诱饵和猎物之间没有相互作用(图4)。结果证实了修饰后的Y3H系统在适用于甲基赖氨酸依赖的蛋白质-蛋白质相互作用的鉴定。

图4酵母细胞中H3(1-20)与CBX1和MPP8染色体结构域的甲基化互作

小编有言

在过去的几年里,基于蛋白质阵列、肽阵列或稳定同位素标记(SILAC)和修饰特异性pull down的各种方法被开发出来识别甲基赖氨酸阅读器。然而,这些方法依赖于特定细胞类型的阅读器在实验条件下的最佳表达,或要求以功能形式表达和纯化候选阅读器。考虑到赖氨酸甲基化在细胞过程中的基本作用,迫切需要开发新的、敏感的技术来发现甲基赖氨酸阅读器。鉴于此本文作者提出了一个修饰的酵母三杂交(Y3H)系统,能够识别甲基化依赖的蛋白质-蛋白质相互作用。


参考文献:

1. Lanouette S, Mongeon V, Figeys D, Couture JF . The functional diversity of protein lysine methylation. Mol Syst Biol. 2014;10:724.

2. Clarke SG. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends Biochem Sci. 2013;38:243–52.

3. Black JC, Van Rechem C, Whetstine JR. Histone lysine methylation dynamics: establishment, regulation, and biological impact. Mol Cell. 2012;48:491–507.

4. Patel DJ, Wang Z. Readout of epigenetic modifications. Annu Rev Biochem. 2013;82:81–118.

5. Bannister AJ, Kouzarides T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 2011;21:381–95.

 

原文链接:https://doi.org/10.1186/s13072‑018‑0175‑3

酵母三杂交系统验证三个蛋白间互作--Y3H实现了赖氨酸甲基化阅读器的鉴定研究
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