红梨因其鲜艳的外观和丰富的花色苷而备受青睐。花青素的生物合成受转录因子（TFs）形成的调节复合物控制。在红皮梨中，WRKY-TFs与花青素生物合成有显著关系，但WRKY-TFs参与调控红皮梨颜色形成的分子机制尚不清楚。

合肥工业大学研究团队在Horticulture Research 发表了一篇名为“PyWRKY26 and PybHLH3 cotargeted the PyMYB114 promoter to regulate anthocyanin biosynthesis and transport in red-skinned pears”的文章揭示了PyWRKY26和PybHLH3 共同靶向PyMYB114启动子以调节红皮梨中花青素的生物合成和转运。

在本研究中，通过转录组数据和生物信息学分析，筛选出TFs PyWRKY31和PyWRKY26作为控制花青素生物合成的候选基因。PyWRKY31或PyWRKY26与其PyMYB10、PyMYB114和PybHLH3共转化后的花青素积累效应通过瞬时表达系统在烟草和草莓中得到验证。RT-qPCR分析和双荧光素酶报告系统进一步证实，这种共转化激活了花青素生物合成中PyDFR、PyANS和PyUFGT的表达，以及花青素转运中PyGST的表达，而不是PyABC转运体和PyAVP。此外，共转化的PyWRKY26和PybHLH3可以结合PyMYB114启动子，PyWRKY26直接激活PyMYB114的转录。此外，萤火虫荧光素酶互补和酵母双杂交（Y2H）分析证实，TF-PyWRKY26可以与PybHLH3相互作用。这些结果表明，PyWRKY26和PybHLH3的相互作用可以协同PyMYB114启动子，从而导致红皮梨花青素的积累。本研究进一步加深了对花青素积累调控机制的理解，有助于改善红皮梨的外观。

图 6：验证体内 TFs PyMYB114、PybHLH3 和 PyWRKY26 的调节模式

为了进一步探索 TFs PyMYB114、PybHLH3和PyWRKY26/PyWRKY31 的关系，我们克隆了PyMYB114的上游 2 kb 启动子，并通过烟叶中的双荧光素酶报告基因分析对其进行了分析。如图所示6a中，用共转化PyWRKY26和PybHLH3对的启动子序列更强的激活作用PyMYB114比其他因素，包括PyWRKY31。的结合PybHLH3和PyWRKY26到PyMYB114启动子经酵母一杂交技术进一步验证。启动子结构分析表明，PlantCARE 预测了多个顺式调控元件（图6b）。将启动子片段诱饵与猎物载体pGADT7- PybHLH3和pGADT7- PyWRKY26融合并导入Y1HGold酵母菌株，结果表明PyWRKY26可以与S2片段结合。然而，我们没有发现之间的直接关联PybHLH3和启动子PyMYB114，虽然有几个结合位点分别位于不同的个体启动子区（图6C）。

为了进一步鉴定PybHLH3与PyWRKY26的相互作用，进行了基于烟草的萤火虫荧光素酶互补测定。PybHLH3被插入到萤火虫荧光素酶（NLuc）的N-末端区域，而PyWRKY26被连接到萤火虫荧光素酶（CLuc）的C-末端区域（图6d）。NLuc- PybHLH3和 CLuc- PyWRKY26构建体的共表达显示出最强的拯救荧光素酶活性的能力（P  < 0.01）。然而，对于控制结构，包括 NLuc- PybHLH3和 C 和 CLuc- PyWRKY26对于 Nluc，未观察到明显的荧光素酶活性（图6e）。

然后，通过 Y2H 测定进一步验证了 PyWRKY26 与 PybHLH3 的相互作用。PyWRKY26和PybHLH3的全长编码序列分别插入 pGBKT7 和 pGADT7。结果表明在AH109酵母细胞中共转化的PyWRKY26和PybHLH3导致培养基上的健康生长（图6f）。首先，结果表明，PyWRKY26与之交互PybHLH3体内。

在这项研究中，TFs PyWRKY31和PyWRKY26与其伙伴PyMYB10、PyMYB114和PybHLH3共同转化为烟叶和草莓花托，并导致花青素含量增加。此外，我们证实这种共转化激活了PyDFR、PyANS和PyUFGT在花青素生物合成中的活性，以及PyGST在花青素转运中的活性，而不是PyABC转运蛋白和PyAVP。此外，萤火虫荧光素酶报告基因检测和酵母表达检测表明PyWRKY26和PybHLH3的相互作用可以cotarget的PyMYB114启动子和PyWRKY26直接激活的启动子序列PyMYB114，这导致在红皮梨花青素的积累。这项研究为花青素积累的调控网络提供了新的见解，有助于改善红皮梨的外观质量。

文献链接: 10.1038/s41438-020-0254-z