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EP|美国研究团队揭示酿酒酵母筛选在草甘膦耐受性上的应用

作者:南京瑞源生物技术有限公司 浏览: 发表时间:2022-04-21 09:01:35

 研  究  背  景

酿酒酵母广泛应用于各种化学物质的毒理基因组学研究。它的好处包括与高等真核生物相关的高度保守的适应、耐受和抗性机制的独特组合,以及基因组水平上的酵母物种内的广泛变异。在整个研究中使用的两个菌株是S288c和RM11。RM11是1993年从一个葡萄园分离出来的加州葡萄园菌株,它对大多数GBH都有抗性。S288c是一株对GBH敏感的实验室菌株。草甘膦是GBHs中的活性成分,它的作用靶点是莽草酸途径。

                       

                         

2020年3月16日美国西弗吉尼亚大学研究团队在Environmental Pollution发表了一篇名为“

Mitochondrial metabolism is central for response and resistance of Saccharomyces cerevisiae to exposure to a glyphosate-based herbicide”的文章揭示线粒体代谢是酿酒酵母对草甘膦除草剂反应和抗性的核心。


材  料  与  方  法

酵母菌株:RM11和S288c菌株。

本研究利用Credit41(Cr41)暴露后RM11和S288c之间的反应差异来进行数量性状基因座(QTL)分析,发现抗性与含有编码线粒体脂肪酸生物合成的线粒体蛋白基因的位点有关。进化出对Cr41抗性的细胞的转录组学数据和全基因组测序数据表明,线粒体内的铁稳态有助于暴露于这种环境压力源的细胞的抗性表型,可能涉及细胞色素和铁硫(Fe-S)簇。在Credit41暴露下,耐药细胞(RM11)的铁浓度显著增加,这可能是其耐药表型的原因之一。铁转运水平的增加对商业配方Cr41和非纯草甘膦(PG)是特定的,表明观察到的影响不是主成分的结果,而是添加剂及其协同作用的结果。

研  究  策  略

                     

                           


研  究  结  果

不同酵母菌株之间的遗传变异导致它们对草甘膦除草剂的耐受性发生变化,研究人员选择以草甘膦为唯一有效成分的除草剂Cr41,酵母斑点越白,细胞对Cr41的耐受性越强,所绘制的2号染色体区域包含两个与CR41抗性相关的基因,它们是AAC3(图1F)和MUD1(图1E)。

                         

                                图1.微量培养基中草甘膦(Credit41)对草甘膦敏感性的遗传连锁分析


利用BY4741(S288c衍生物)敲除文库,对所鉴定的QTL中的所有S288c基因敲除突变体进行检测 (图2)。在微量培养基中,所有RM11突变体对Cr41和PG都有抗性。野生型和所有S288c突变体(hfa1D、aac3D和tir1D)除mud1D外,对Cr41敏感,但对PG有抗性。这表明S288c对商用除草剂Cr41配方中的添加剂具有特异性,而不是仅对草甘膦具有特异性。

                         

                                      图2.RM11和S288c(BY4742)单倍体突变体在Credit 41(Cr41)暴露下的生长


与S288c中的单个突变体相比,在抗性品系RM11中测试的所有候选QTL的单个突变体在Cr41存在下的生长没有改变。为了确定这些基因是否与RM11的抗性有关,构建了这些候选基因的双突变体,并将其暴露于Cr41(图3)。

                                                    

                                                     图3.暴露于Cr41中的RM11双敲除体的生长 


进行了转录组分析,酵母菌在液体培养中生长,暴露在Cr41中90min,提取RNA,转化为cDNA,并对文库进行测序,根据KEGG途径分析,果糖和甘露糖代谢是唯一上调的途径(图4A)。KEGG途径分析表明,磷酸戊糖途径、碳代谢和次生代谢物的生物合成显著下调(图4B)。Cr41对线粒体基因的影响可能会阻碍碳代谢过程,进而阻碍许多次生代谢物的产生。

                                           

                                        图4.RM11在微量培养基中暴露于草甘膦(Credit41)时的基因表达分析


抗Cr41的ILE(实验室内进化)菌株显示多个线粒体基因重复,两个敏感菌株(YJM789和S288c)和两个抗性菌株(AWRI1631和RM11)长时间暴露于Cr41中,以确定它们获得草甘膦抗性的途径,筛选出Cr41抗性酵母。259个ILE基因编码的蛋白质中有32个是线粒体蛋白质组的一部分(图5A)。

                                                  

                                                图5.分析实验室内进化中受影响的基因及其与线粒体的关系


转录组分析显示金属转运蛋白FIT2、FIT3、CUP1和FRE5在耐药株RM11中的调控。经草甘膦处理的细胞内元素水平在Cr41和PG暴露之间变化(图6)。在经Cr41处理的RM11中,观察到铁浓度增加(p值¼0.04)(图6A)。锌含量增加(pvalue¼0.006)仅在PG暴露于RM11的情况下增加(图6)。

                           

                                                                  图6.暴露于草甘膦的金属量的变化


研  究  结  论

草甘膦类除草剂是世界上使用最广泛的除草剂,有大量的商业配方,含有不同的添加剂和佐剂。我们研究了一个敏感的实验室菌株和一个抗性菌株之间的数量性状基因座(QTL)分析将线粒体功能与Credit41抗性联系起来。通过QTL分析确定的两个编码线粒体蛋白质的基因是HFA1(一个编码线粒体乙酰辅酶a羧化酶的基因)和AAC3(编码线粒体内膜ATP/ADP转运体)的基因。对先前研究的全基因组测序数据的进一步分析表明,尽管每个菌株通过不同的途径获得抗草甘膦的能力,但大多数菌株都有线粒体基因的重复。线粒体的一个最深入研究的功能是Fe-S簇的组装。在目前的研究中,铁转运体在转录组中的表达在对Credit41耐药的细胞中增加。细胞内的铁含量也在暴露于Credit41的细胞中增加,但不包括纯草甘膦。因此,草甘膦除草剂中的添加剂对这些商业制剂对生物系统的负面影响有重要贡献。


参  考  文  献

1. Amrhein, N., Deus, B., Gehrke, P., Steinrücken, H.C., 1980. The site of the inhibition of the shikimate pathway by glyphosate, 66, 830e834.

2. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., et al., 1995. Short Protocols in Molecular Biology, vol. 1995.

3. Becher, M.W., Wills, M.L., Noll, W.W., Hurko, O., Price, D.L., 1999. Kearns-Sayre syndrome with features of Pearson’s marrow-pancreas syndrome and a novel 2905-base pair mitochondrial DNA deletion. Hum. Pathol. 30, 577e581.

EP|美国研究团队揭示酿酒酵母筛选在草甘膦耐受性上的应用
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