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新型酿酒酵母表面展示系统的构建及鸡球虫EtMⅰc2活载体疫苗的免疫保护性研究

作者:南京瑞源生物技术有限公司 浏览: 发表时间:2022-05-12 08:36:34

随着DNA 技术的发展,微生物的表面展示技术也有长足进步。微生物表面展示系统广泛应用于开发全细胞催化剂、研究蛋白质间的相互作用、筛选抗体和研发口服活载体疫苗等方面。除了噬菌体展示,细菌表面展示和酵母表面展示也相继报道。酿酒酵母是公认的益生菌,不但对机体安全无毒,而且能够有效刺激机体的非特异免疫,提高免疫力。以酵母作为表达载体,制备的疫苗在抗菌、抗病毒方面显示了很好的疗效。然而,利用酵母制备抗球虫的口服活载体疫苗还未见报道。


2014年 山东农业大学赵孝民团队孙慧博士论文揭示新型酿酒酵母表面展示系统的构建及鸡球虫EtMⅰc2活载体疫苗的免疫保护性研究。

刺激机体提高免疫力的有效成分是酵母细胞壁,利用双向电泳比较疫苗株与原酵母株的差异蛋白组,以期评价EtMic2的展示对酵母细胞壁蛋白组的影响。


酵母表面展示质粒pYSD的构建

以含双向启动子 TEF1 和 PGK1 的 pSP-G2 为基础质粒,利用分子克隆的方法依次连入筛选标记 KanM、AGA1、AGA2 表达盒,其中,AGA1 和AGA2 表达盒分别位于两个双向启动子的下游,从而构建酵母表面展示质粒 pYSD。用 G418 的抗性基因 kanM作为筛选标记,代替原来质粒上的营养缺陷型筛选标记 URA3。

分别将 AGA1和 AGA2 表达盒插入到 PGK1 和 TEF1 启动子的下游构建展示质粒 pYSD。因为 PGK1 和 TEF1 具有相同的表达效率(Partow et al,2010),将展示质粒转入表达菌后,会实现 Aga1p  和 Aga2p 的同步表达获得良好的展示效率。

在 pYSD 展示质粒的 AGA2 表达盒的多克隆位点的上、下游分别插入 Xpress 标签和 V5 标签,当外源蛋白没有合适抗体进行检测时,可以使用标签抗体进行相应检测。上游的 Xpress 标签可以被蛋白酶水解,水解后标签和目的蛋白分离从而达到分离纯化的目的;V5 标签在多克隆位点的下游,下游标签常被用作检测插入的蛋白是否正确表达。


EtMic2 的表面展示结果

1、pYSD-EtMIC2 的构建 

以 E.tenella cDNA 为模板,扩增带有 Xho I 和 Apa I  酶切位点的去掉信号肽的 EtMIC2,插入到 AGA2 表达盒的 Xho I-Apa I 位点之间,酶切鉴定的得到 951 bp 和 10 Kb 的条带。

2. EtMic2 的表面展示结果(检测蛋白的展示效率)

将构建的 pYSD- EtMIC2 分别转化酿酒酵母工程菌(EBY100、W303-1A)和酿酒酵母野生株(HAO、CICC1224),依次命名为 EBY100/pYSD-EtMIC2、W303-1A/  pYSD- EtMIC2、HAO/ pYSD- EtMIC2、  CICC1224/ pYSD- EtMIC2。挑选菌落进行 PCR 鉴定,结果见图 3-8,出现 1500 bp 的条带的为阳性。


3、EtMic2 的表面展示结果(检测蛋白的展示效率)

分别取诱导 12 h、24 h、36 h 的表达产物,做 IFA 鉴定,一抗为 EtMic2 单抗,二抗为 FITC 标记的羊抗鼠 IgG(H+G),细胞表面从诱导后 12 h 开始,有点状绿色荧光出现在酵母细胞壁上,到 24 h 整个酵母细胞表面被绿色荧光包围。为进一步对表达量进行测定,选用流式细胞仪进行分析,EBY100/pYSD-EtMIC2、W303-1A/ pYSD-EtMIC2、HAO/ pYSD- EtMIC2、 CICC1224/ pYSD- EtMIC2 的表达量在 65% - 70%之间(图 3-9)。

图 3-9

外源蛋白的展示对酵母细胞生长的影响

为了解外源蛋白的展示是否对酵母细胞的生长有影响,测定不同菌株的生长曲线。在相同试验条件下,测定 HAO、HAO/p YSD、HAO/p YSD-GFP 和 HAO/p YSD-EtMIC2的生长曲线,计算各菌株的倍增时间(doubling time)。在群体生长里细菌数量增加一倍所需的时间称为倍增时间(Doubling time)。如表所示,四个菌株的倍增时间依次为1.357±0.008、1.369±0.018、  1.344±0.016 和 1.353±0.010,经统计分析无明显差异。因此,外源蛋白的展示对酵母细胞的生长无影响。




新型酿酒酵母表面展示系统的构建及鸡球虫EtMⅰc2活载体疫苗的免疫保护性研究
随着DNA 技术的发展,微生物的表面展示技术也有长足进步。微生物表面展示系统广泛应用于开发全细胞催化剂、研究蛋白质间的相互作用、筛选抗体和研发口服活载体疫苗等方面。除了噬菌体展示,细菌表面展示和酵母表面展示也相继报道。酿酒酵母是公认的益生菌,不但对机体安全无毒,而且能够有效刺激机体的非特异免疫,提高免疫力。以酵母作为表达载体,制备的疫苗在抗菌、抗病毒方面显示了很好的疗效。
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