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PEAP|外国学者揭示毕赤酵母表达重组人激活素A的合成、纯化及生物活性

作者:南京瑞源生物技术有限公司 浏览: 发表时间:2022-05-31 08:58:11

转化生长因子-β (TGF-β) 超家族成员激活素 A在调节多种生理过程中发挥核心作用,包括细胞分化、有丝分裂、胚胎发生、细胞凋亡和炎症。在正常细胞中,激活素 A 信号传导受到调节以维持细胞和组织健康并抑制肿瘤生长。激活素 A 信号传导的破坏与肿瘤形成和进展有关。因此,激活素 A 的可用性是开发用于治疗干预的诊断方法和药物的重要目标。

为此,我们在毕赤酵母中表达了人类激活素 A ,使其分泌到培养基中并纯化为成熟的同源二聚体。构建了编码单体前体蛋白的构建体,该蛋白具有 N 端 FLAG 亲和标签 (DYKDDDDK) 和 Kex2p蛋白酶的切割位点 (EKR) 。




2008 年11月7日澳大利亚研究学者在“Protein Expression and Purification”发表了一篇名为“Synthesis, purification and bioactivity of recombinant human activin A expressed in the yeast Pichia pastoris”的文章揭示了毕赤酵母表达重组人激活素A的合成、纯化及生物活性。

激活素A也在几种哺乳动物细胞系中重组表达,但这可能导致细胞毒性或产生大量未清除的高分子量激活素A前体形式。此外,这种细胞系中存在天然结合伙伴意味着高比例的激活素分子将与其他细胞表面蛋白和多蛋白复合物相关。使用大肠杆菌等宿主不适合表达具有生物活性的重组激活素a,因为原核生物缺乏将前体蛋白正确加工成具有生物活性的成熟激活素a分子所需的细胞内机制。杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的激活素A被分泌到培养基中,并被证明具有生物活性;然而,产量通常非常低,昂贵又耗时。

毕赤酵母是一种已成功用于表达420多种不同重组蛋白的生物体。这种酵母细胞工厂在产量和成本方面比真核细胞系具有特殊优势,同时保持了TGF-b蛋白前体的糖基化和二硫键模式。在基因整合到宿主染色体并使用强大的可诱导AOX1基因启动子诱导表达后,激活素A前蛋白被加工成成熟的同型二聚体,同时分泌到培养基中

最近,在毕赤酵母中表达并纯化含有不可移除N末端肽标签序列的重组人激活素A,但此类变体的生物活性降低。在这项研究中,我们设计了一种含有蛋白水解可切割标签的重组人激活素,以产生天然存在的人类同型二聚体蛋白的重组等效物。我们还研究了标记和去标记的人脐静脉内皮细胞的生物活性细胞。

通过离子交换和抗 FLAG 抗体亲和层析对人激活素 A 进行两步纯化的程序,以及通过肠肽酶从纯化的重组人激活素 A 中去除 FLAG 亲和标签的程序。标记和去标记的人激活素 A 的分子量通过 MALDI-TOF 质谱法确认。这些重组激活素的生物活性评估了它们对调节人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 分泌内皮素-1 (ET-1) 的影响。含有完整FLAG 标签的重组人激活素 A导致 HUVEC 分泌的 ET-1 减少,而在去除该亲和纯化标签后,纯化的重组人激活素 A 将 ET-1 分泌恢复到与阳性对照相当的水平。这些结果证明了一种用于简单、大规模表达和纯化这种重要的人类生长因子用于诊断和治疗目的的方法具有相当大的潜力。


                                

                                图4。SDS-PAGE(A和D)、抗人激活素bA Western blot(B和E)和抗FLAG Western blot(C和F)分析重组人不同阶段的表达激活素A纯化,每条通道包含24 l体积的样品



图6。人激活素A分子对人脐静脉内皮细胞分泌内皮素-1(ET-1)的影响


我们已经证明,在体外去除来自人类激活素b A亚基的标志标签在生物学上导致活性人类激活素A,可用于诊断或治疗治疗目的。在这项研究中,还可以应用于表达和纯化TGF-b超家族的其他成员,这些成员也需要pro区域的存在和切割才能充分发挥功能,并随后生成去标记的蛋白质供下游使用。此外,这种用于活化素脱纯化和体外切割的替代性标记技术的开发可能会导致这种重要的人类生长因子的低成本大规模工业化生产。

PEAP|外国学者揭示毕赤酵母表达重组人激活素A的合成、纯化及生物活性
转化生长因子-β (TGF-β) 超家族成员激活素 A在调节多种生理过程中发挥核心作用,包括细胞分化、有丝分裂、胚胎发生、细胞凋亡和炎症。在正常细胞中,激活素 A 信号传导受到调节以维持细胞和组织健康并抑制肿瘤生长。激活素 A 信号传导的破坏与肿瘤形成和进展有关。因此,激活素 A 的可用性是开发用于治疗干预的诊断方法和药物的重要目标。
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