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硕士论文|暨南大学刘静采用酵母双杂交技术筛选抗人CXCR4的单链抗体及其初步分析研究

作者:南京瑞源生物技术有限公司 浏览: 发表时间:2022-06-29 09:28:17

肿瘤是一种常见病,多发病,目前恶性肿瘤是威胁人类健康最严重的疾病,目前对于治疗恶性肿瘤,一般都是放疗、化疗、药物辅助以及生物治疗,但是由于恶性肿瘤细胞易增殖、转移和复发,因此治疗效果预后较差。靶向治疗肿瘤干细胞为肿瘤治疗开拓可新思路,成为研究和治疗癌症的又一大热点。


 

CXCR4作为肿瘤干细胞表面标记物,它与肿瘤的恶性发展有着密切的关系。其次,单链抗体具有分子量相对较小,容易渗透到肿瘤组织中,免疫原性低,半衰期短,能单独或偶联某些药物靶向作用于肿瘤组织,降低对正常组织的伤害,这也是抗体工程的热点,加之酵母双杂交技术的优势。因此选CXCR4作为靶标,利用酵母双杂交技术从人的单链抗体文库中筛选出CXCR4的单链抗体,为研发治疗恶性肿瘤的抗体类药物提供了基础。


蛋白-蛋白的相互作用存在于机体细胞的生命活动过程中,是生命活动的重要依据。传统上检测蛋白相互作用有蛋白免疫印、免疫沉淀等方法,但是这些方法只是在体外进行检测,不能很好的模拟人体体内蛋白相互作用的情境。在1989年Fieds和Songs首先提出并建立一种在细胞内直接检测蛋白相互作用的遗传学新方法,即酵母双杂交系统。随后该系统不断的完善,酵母双杂交技术不仅能检测蛋白-蛋白之间的相互作用,还能检测出未知功能的蛋白,即使蛋白-蛋白,抗原-抗体之间微弱、瞬间的联系也能根据报告基因表达产物敏感的检测出来,在蛋白研究方面起到了非常重要的作用。

因此,我们先构建CXCR4诱饵融合蛋白表达载体,通过酵母双杂交技术来筛选CXCR4相互作用的单链抗体,筛选出的单链抗体进行纯化后进一步分析单链抗体的抗肿瘤活性研究。由于一些蛋白转化到酵母菌株AH109中可能蛋白本身具有激活报告基因表达,在文库筛选之前需要对诱饵蛋白进行自激活检测。本次实验将p GBKT7-CXCR4转化到AH109中来验证是否有自激活作用, p GBKT7在酵母菌株中带有Trp的营养标记,因此能在-Trp板上生长。在含有p GBKT7-CXCR4酵母AH109中,DNA结合结构域(DNA-BD)能与上游激活序列(UAS)结合,但是缺少转录激活结构域(DNA-AD)的结合,因此GAL4  UAS下游启动子调节的报告基因ADE,HIS3均不能被转录激活表达,即不能在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade的培养上生长。有图3-3的实验结果表明,含有诱饵蛋白的酵母AH109在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade的培养上不生长,说明诱饵蛋白没有自激活作用,因此p GBKT7-CXCR4质粒适用于酵母双杂交系统进行筛选单链抗体。

本实验采用酵母双杂交系统是GAL4 Two-Hybrid System3,选用酵母菌株AH109菌株,该菌株已经敲除了GAL4基因,不能表达GAL4内源蛋白,GAL4调控的四个报告基因HIS3、Ade、MELI和Lac Z,其中His、Ade用于营养筛选。在本系统中带有两种不同的质粒,其中诱饵质粒带有Trp营养标记,文库质粒带有Leu营养标记,His、Ade报告基因能提供很强的营养筛选,同时加上3-AT能抑制His本底表达,增加筛选的严谨度。筛选出的单克隆在SD/-Trp/-leu /-His/-Ade+10m M3-AT板上进行划线,进一步鉴定候选阳性克隆。

硕士论文|暨南大学刘静采用酵母双杂交技术筛选抗人CXCR4的单链抗体及其初步分析研究
肿瘤是一种常见病,多发病,目前恶性肿瘤是威胁人类健康最严重的疾病,目前对于治疗恶性肿瘤,一般都是放疗、化疗、药物辅助以及生物治疗,但是由于恶性肿瘤细胞易增殖、转移和复发,因此治疗效果预后较差。靶向治疗肿瘤干细胞为肿瘤治疗开拓可新思路,成为研究和治疗癌症的又一大热点。
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