此前的TF-centered Y1H 可以确定结合的基序，然而，它必须使用Sanger测序技术对阳性克隆进行逐一测序，存在效率低的缺点也不能像ChIP-Seq那样识别基序特定位置不同碱基的频率。

全新升级

南京瑞源生物技术有限公司研发团队联合沈阳农业大学王玉成研究团队对传统TF-centered Y1H改良升级，将可全面识别TF结合潜在基序最新实验策略的科研成果发表在期刊BMC Plant Biology。升级后的TF-centered Y1H与高通量测序技术相结合，可快速筛选出感兴趣的TF结合的基序的同时还可以确定基序特定位置不同碱基的频率。该方法将在全面确定TF结合的基序方面得到广泛的应用。

科研思路

在pHIS2中插入随机的DNA序列作为猎物文库，并将目标TF克隆到pGADT7-Rec2中作为诱饵（图1）。然后进行 Y1H 获取阳性克隆，分离出pHIS2的载体。以pHIS2文库为模板，对pHIS2的插入区域进行PCR扩增，然后对PCR产物进行高通量测序分析。从reads中检索插入序列，并使用 MEME 或其他程序进一步分析，以确定可能与所研究的蛋白质结合的DNA 基序（图1）。

图1 改进的以转录因子为中心的酵母单杂交体（TF-Centered Y1H）的原理和程序

与以前的方法相比，本研究改进了以下几个方面：（1）改进了用于 TF-Centered Y1H 的猎物库，以包含许多随机基序序列；(2)利用高通量测序确定插入序列；(3)进行生物信息学分析以确定保守的基序，并以高通量识别DNA基序，从而能够全面识别TF结合的基序。

图2使用酵母单杂交系统分析 BpERF2 与选定基序的结合

图3所选基序与 BpERF2 结合的EMSA 验证

图4ChIP分析以验证 BpERF2 与所选基序的结合

瑞源生物研发团队突破了科研困境，引入序列随机化的方法进行了随机DNA文库的构建，该文库包含有3×4⁷种序列，然后再利用酵母单杂交技术筛选文库鉴定转录因子特异性结合的DNA序列。升级后的系统可快速筛选出感兴趣的TF结合的基序的同时还可以确定基序特定位置不同碱基的频率，可全面揭示TF结合的基序让基因调控网络一目了然！