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TF-Centered Y1H

▼服务简介

酵母单杂交技术是在酵母双杂基础上发展而来的一种研究核酸-蛋白相互作用的工具,被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控,如鉴别DNA结合位点发现潜在的结合蛋白基因、分析DNA结合结构域信息等。

 

▼服务简介

基于酵母单杂交技术建立了一种以转录因子为中心鉴定其识别作用元件的技术,命名为TF- centered YIH。该技术能够准确、快速简捷、高效的鉴定出转录因子识别的元件,在蛋白质与DNA元件的互作研究中有着广阔的应用前景。

▼实验原理

在该系统中,首先构建随机DNA文库,再利用酵母单杂交技术筛选文库鉴定转录因子特异性结合的DNA序列。研究的转录因子作为 Bait,随机的短的 DNA 序列文库克隆到pHIS2载体中作为Prey,一个元件序列足够与TF结合。

▼技术优势

1、可全面了解转录因子识别元件。

2、可快速地鉴定一个特定转录因子结合的各种顺式作用元件。

3、拓展了酵母单杂交的应用范围,使其既可以用于gene-centered研究,也可以用于TF-centered 研究。

4、TF-Centered Y1H可以用于识别转录因子结合的各种元件,且其假阳性率要远远小于Gene-centered Y1H。

5、该方法可以发现大量新的顺式作用元件,方法简单,快速有效。

▼应用前景

1、可以与ChIP-seq相结合,揭示元件的调控作用。

2、在无ChIP-seq结果的情况下,TF-Centered Y1H鉴定的元件可以根据qRT-PCR或RNA-seq获得的下游靶基因,进行这些基因启动子元件的扫描。

3、利用该文库进行Gene-centered Y1H,将显著减少假阳性。

▼案例展示

利用AtbZIP53蛋白筛选随机DNA文库(Plant Mol Biol. 2014, 86:367-380)

bZIP转录因子是一类重要的植物转录因子,在植物的生长过程中发挥着重要的作用。迄今为止,只有少数bZIP家族成员被研究,且发现它们主要结合核心序列为“ACGT”的顺式作用元件。然而,它是否识别其他顺式作用元件,进而发挥相应的生物学功能,尚不清楚,所以我们选择bZIP53筛选随机DNA文库,共获得一个未知元件和5个已知的DNA序列。

▼常见FAQ

1、为何合成两条含有插入序列的引物?

共有3×47即49512种序列。

2、为何仅仅构建随机序列为7bp的文库?

因为对于新的元件需要确定边界,插入序列越长,确定边界工作量越大。这样可以减少确定新元件边界的工作量。

3、为何将随机序列插入SmaI酶切位点?

因为其酶切序列为CCCGGG,这个序列正好可以作为识别插入序列的标记位点,即形成了CCCHNNNNNNCGGG,CCC和GGG为标记位点。

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